了解细胞凋亡及其检测方法

冷血豪情 · 发表于 2023-5-19 19:32:53

细胞凋亡在一些情况下，

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1细胞凋亡的概念

细胞凋亡（C）是一个主动的由基因决定的细胞自动结束生命的过程，是细胞为维持内环境稳定而有序性地死亡，它涉及一系列基因的激活、表达和调控等作用，具有生理性和选择性的。

2细胞凋亡的特征

（1）形态学变化：比较初细胞体积缩小，细胞间接触消失，与周围细胞脱离；之后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜、核仁破裂，胞膜有小泡形成，胞膜结构依旧完整，比较终可将凋亡细胞分割包裹成几个凋亡小体，内容物外溢；凋亡小体可以被周围专职或非专职的吞噬细胞吞噬。

（2）生物学变化：DNA发生有控降解，片段化的DNA片段为0-0的整倍数；在细胞凋亡的过程中，也常有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。

3细胞凋亡的生理意义

（1）维持多细胞生物个体发育的正常进行；

（2）保持自稳平衡；

（3）抵御外界各种因素的干扰。

细胞凋亡的检测方法

1

1形态学观察

根据凋亡细胞固有的形态特征，用台盼蓝、DAPI或G染色，然后在光学显微镜下观察，或直接在电镜下观察。

2DNA片段化检测

细胞发生凋亡时，DNA发生特征性的核小体间的断裂，产生大小不同的片段，但都是0~0的整数倍，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA。

3彗星电泳法

彗星电泳的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶电泳中，经裂解处理后，产生大小不同的片段，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA断裂片段，在电场中游动速度较，使细胞核呈现出一种彗星式图案。

4TUNEL测定法

即DNA断裂的原位末端标记法，细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞。

5流式细胞分析法

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。A-V是一种分子量为35~36KD的C2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将A-V进行荧光素（FITC、PE）或标记，以标记了的A-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将A-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

6CR检测法

结合A-VFITC和PI染色液，对细胞样品进行处理，然后在R仪器上进行检测，然后流式分析导出，在FCS类流式软件上进行分析，得到散点图结果。

其验步骤如下：

①每个样品收集约~50万个细胞于毫升离心管内（如细胞密度为0万个L，则取500微升体积悬液用于后续验）；将细胞在400转速条件下离心3分钟，弃上清，用0微升PBS进行重悬；用移液轻轻吹打混匀，400转速条件下离心3分钟，弃上清，用0微升AVBB重悬；

②向细胞悬液中加入微升A-V-FITC染色液；

③加入4微升PI染色液；

④混匀，室温避光孵育~分钟；

⑤400转速条件下离心3分钟，弃上清，用0微升AVBB进行重悬；

⑥400转速条件下离心3分钟，弃上清，用0微升AVBB进行重悬；

⑦在分钟内完成检测，检测之前，避光保存。吸取微升悬液，加入细胞计数板，插入仪器样品槽里，选择“细胞凋亡”验类型，进行检测；流式分析导出，在FCS软件上进行分析，如图1和2。

（PS:仅限于研究用途，不可用于诊断操作）

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