聊一聊：细胞计数指南 ——解读ISO 20391-1

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解读ISO 20391-1 Biotechnology-Cell counting- Part 1 :General guidance on cell counting methods准则众所周知，新闻动态的出现值得很多人的关注，激起了整个市场的波澜。Countstar诞生于2009年，隶属于艾力特生物科技（上海）有限公司旗下子公司---上海睿钰生物科技有限公司，其负责产品的研发和生产，致力于现代细胞分析技术研发和仪器制造。

随着NMPA对首个产品的批准上市（参见《首个CAR-T获批上市复星凯特阿基仑赛一石激起千层浪》），CAR-T疗法在国内引起了前所未有的关注热度。与此同时的间充质干细胞产品也呈现出了新的速度。在我国，截止目前，国内共13款间充质干细胞药物获准默许进入临床试验。这也就意味着更多的患者能够使用间充质干细胞治疗产品的时代越来越近。


伴随着细胞治疗产业的迅速发展，国内愈发需要一个能衡量细胞数量和分析细胞活率的规范准则。目前为止，现有的标准只有国际标准化组织（ISO）2022年发布的ISO20391-1-2022《生物技术-细胞计数-第1部分：细胞计数方法的通用指南》和2022年发布的ISO20391-2:2022《生物技术-细胞计数-第2部分：用验设计和统计分析来量化计数方法的性能》。



这期给大家解读一下ISO20391-1-2022《生物技术-细胞计数-第1部分：细胞计数方法的通用指南》的相关内容，帮助大家提高细胞计数的质量，同时也希望国内的行业标准可以尽到来。




样品制备-取样-测量-鉴定及验证


细胞计数根据验目的的不同，选择的处理措施也各不相同，但是在不同方法之间我们需要关注的操作行为还是有不少的通性，那我们需要注意的操作行为主要有以下几点：

1、细胞样品的制备

a）样品制备过程会出现系统或随机的方式改变细胞样品，可能降低其对更大整体的代表性，导致测量结果的偏差。

b）细胞碎片的存在可能导致细胞数量的出现波动。细胞碎片对计数的影响，应提前考虑。如有可能，应在计数前或计数过程中清除或定性碎片。

c）聚集体存在可能导致细胞计数不足。应制定样品制备程序，以便在提取等份样品之前制备分散良好的样品。

d）应尽量减少可能影响细胞计数方式而改变样品的环境因素。环境因素包括温度、湿度、光照、菌条件和气流。例如：细胞样本的保存温度可能会改变其属性，需要相应地进行选择。

e）应考虑设备和耗材对细胞计数的影响，选择适当的容器和转移设备，以尽量减少与样品转移过程中的细胞损失。

f）混合方法（例如模式、速度、持续时间）以及过程中的等待。这些都可以改变计数结果。细胞混合程序的设计应尽量减少对计数测量的影响。

g）稀释细胞时，应尽量减少测量细胞悬浮液或稀释液体积的误差。




2、细胞取样

a）细胞计数通常通过从较大的整体中提取的一个或多个样本来测量。应使用适当的取样程序，以比较大限度地减少与测量细胞样本相关的取样误差，而不是测量整个批次或批次（例如主细胞库、整个细胞群）。

b）当从悬浮细胞中提取一份小份样本时，悬浮液应足够均匀，使该样本能够代表悬浮液。悬浮液中异质的多少可导致小份样本测量出现偏差。

3、测量

a）应在正常维护的设备上进行细胞计数，计数仪应定期进行校准及验证相关测试。

b）细胞计数测量过程可能需要化仪器设置。例如：当细胞种类发生变化时。

c）测量值应在预期用途方法的合格范围内。验证范围的下限应大于定量限。

d）细胞计数测量应在规定的时间限制内进行，应考虑测量过程中样品的稳定性。信号强度的损失或细胞属性的变化会影响样本。

e）应尽量减少不同操作员之间的偏差。培训、验证、自动化系统的施对于验者至关重要。




4、数据分析和报告

a）细胞计数中，图像分析可用于识别细胞物体并从分析中排除碎片。图像分析也可用于识别样本中特定的细胞亚群。基本图像处理可以包括图像亮度和对比度的校正，图像分析用于推导细胞计数。

b）数据报告应包含足够的详细信息，以便对细胞计数结果进行单独评估。报告要素可包括：样本ID、样本描述（类型、批号、来源）；试剂-称、来源、批号；样品制备程序和条件；使用的仪器-包括仪器设置；鉴定、验证和验证计划；具有合适计量单位；数据分析程序；意外情况。




5、鉴定和验证

a）应进行安装鉴定（IQ）和操作鉴定（OQ）。可使用仪器制造商定义的安装鉴定（IQ）和操作鉴定（OQ）

b）性能鉴定（PQ）应按照文件规定按照预定顺序进行。

c）理想情况下，通过评估分析结果的平均值与通过认证标准物质获得的参考值之间的差异来验证准确度。也可使用多个试验设计或其他已建立的方法。

d）应记录并维护验证计划。验证计划应包括预期用途的方法性能参数。验证结果应记录在案。

e）使用的标准物应确保测量可追溯性，可进行重复测量。

f）可使用适当的参考材料校准细胞计数方法。参考材料也可用于培训或验人员能力验证。

ISO 20391-1-2022《生物技术-细胞计数-第1部分：细胞计数方法的通用指南》中主要阐述在细胞计数的过程中应该注意哪些因素，哪些操作可以提高细胞计数的质量。感兴趣大家可以去搜寻文件，去了解更详细的细胞计数准则。

下期我们将解读ISO20391-2:2022《生物技术-细胞计数-第2部分：用验设计和统计分析来量化计数方法的性能》，如何用方法学来评估我们的细胞计数。