新闻风向标美国药典（USP-NF1044）细胞的冷冻保存规定（中英文）2023/4/27 14:47:37

huhaorong1984

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细胞的冷冻保存

INTRODUCTION

引言

C,,T-'CD,,,,,,

冷冻保存是将细胞、组织或器官在超低温环境下存储来维持其活力的过程。目的是将细胞储存起来并应用到后续的体内外验中，因为复苏后的细胞仍可以保持冻存前的功能。冷冻保存还可以比较大限度地降低由于细胞复制而导致的基因突变或亚群发育的风险。根据不同的应用，充分的冷冻保存后的功能可通过细胞分裂、增殖、分化、表达基因或产生蛋白质的能力或其他特定的功能特性来评估。

PRINCIPLESOFCRYOPRESERVATION

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冷冻保存的原理概述

U,,W,H,1940PS,(CPA),TCPAH,,CPA,F,-()CPA[,(DMSO),,,]T()CPA(,)TT,CPA

了解水的作用以及将水从细胞中充分去除或消除其形成冰晶的能力以减少损坏细胞膜损伤，这对于成功进行冷冻保存至关重要。当细胞在水性悬浮液中冷冻时，通常会被破坏。在1940年代，P等人发现了甘油的防冻特性。从那时起，陆续鉴定出了几种通常称为冷冻保护剂（CPA）的化学物质。CPA的作用机制很复杂，尚未完全了解。但是，根据公认的依数作用理论，CPA会增加细胞内和细胞外的溶质浓度，从而抑制冰晶的形成。因此，所谓的穿透性（或细胞内）CPA[例如二甲亚砜（DMSO）、甘油、丙二醇和甲醇]必须能够轻松穿过细胞膜而没有明显的性。还有一组非渗透性（或细胞外）CPA（例如蔗糖和海藻糖），其作用机制被认为至少部分与细胞膜的稳定相互作用有关。这种性质也可以解释某些大分子化合物例如羟乙基淀粉和聚乙烯丙烯的防冻活性。冷冻保护的理论模型通常唤起依数理论，但尚未建立对CPA作用的完整解释。

A,,CPA(),-W(100°–1000°),T,,'

另一种细胞保存方式，通常称为玻璃化，即在细胞悬浮液中加入高浓度的穿透性CPA（通常是几种），诱导形成玻璃化状态，诱导细胞和细胞外水不易形成冰晶。当以这种方式制备的细胞悬液速冷却（冷却速率为100°–1000°或更高）时，极高的粘度可防止渗透，并且水分子法形成冰晶。这个过程已广泛用于各种复杂结构的保存过程，包括各种人类、植物和动物组织在内，并且可以帮助保存具有不同程度的细胞渗透性的细胞制剂，或者也用于在所有组织的组成细胞类型标准冷冻保护程序法提供其生存能力的条件范围内的比较佳保存方案。

CPAS,DMSO,,,T,CPA

CPA具有超出其防冻特性的生物学活性。诸如DMSO等，可能会影响细胞膜、细胞骨架和基因表达，并且在细胞长时间暴露后可能对细胞有。因此，在开发新的低温保存方案的过程中，分析人员应进行性试验，将细胞在一定时间间隔内暴露于CPA，以评估活力丧失或功能改变。



KECP

低温保存的关键因素

F,:

对于任何冷冻保存的细胞样品或治疗产品，方法开发应解决以下要素:

PREFREEZEPROCESSINGANDCHARACTERIZATION

预冷冻处理和鉴定

OT,,P,,

冷冻保存之前对细胞条件进行化是获得成功的关键。预冻处理的性质和程度取决于为保存而收获的原始细胞的状态、细胞悬液的组成及冷冻保存的特定处理步骤。预冷冻过程可能包括亚种群的选择、体外扩增或激活或启动因子孵育。

PF,,(),,CF,,ICI,

在早期工艺开发过程中应确定好低温保存的特性。尤其是细胞库，应记录细胞状态和比较佳生长条件，以及历史记录(可追溯到合格的细胞库或可接受的来源)、特征和真性。通常根据来自原代细胞或原始分离株的操作或培养传代的性质和数量来描述细胞的状态和历史。有限细胞系或原代细胞通常会在早期传代时进行冷冻保存来保持原始组织的完整性，而连续细胞系可以通过克隆和扩增保持细胞群体同质性。建议从单一制备物或扩大的细胞群中制备细胞库，因为通常需要将细胞从多个培养容器中汇集起来进行冷冻。来自不同传代历史的培养细胞和来自不同捐赠者的细胞当然不应该混合在一起。在这两种情况下，分析人员均应保留操作过程的详细记录。

T,HT,,T1010LCA,P,

准备低温保存的细胞应该在指数生长或比较速生长阶段和培养进入平台期之前进行收集。在此阶段收集细胞可确保细胞比较具活力和均一性。冻存细胞的比较佳浓度取决于细胞类型、用途和比较佳回收率。对于制造细胞库来说，这个值通常在106到107L之间，但是出于其他目的可能会有所不同。在细胞收获的前一天完全更新生长培养基也会有益处。此外，大多数细胞悬浮液通过离心洗涤和在等渗介质中重悬来达到特定的细胞浓度。在冷冻过程开始前，预冷冻处理不应使细胞受到压力，否则在冷冻过程中或解冻后细胞损失将会高于预期。

OT,,ST,-(,)(,2022WHOFDA2022A)I,

化细胞系或原代细胞的生长条件对保持细胞在培养中的高活力很重要。通常情况下，活跃且处于指数生长期的细胞具有较低的细胞质与细胞核的体积比，这有利于穿透性冷冻保护剂成功进行冷冻保存。欠佳或不合适的培养条件可能会导致存活率降低和细胞状态变差，不利于冻存复苏。需要化培养基，并且在所有验中都应使用相同的培养基，对每批动物来源的材料（例如血清）和其他培养试剂进行鉴定（如见在附录中引用的2022年WHO指南和2022年FDA指南）。如果可能的话，建议不要在培养基中使用动物来源的成分，尤其是用于治疗或作为生成底物的细胞。

PWHO2022,MCB(MCB)WCB(WCB)

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